Ускоренный метод контроля мембранных фильтров для бактериологического анализа воды

Аннотация

Разработан ускоренный алгоритм контроля мембранных фильтров, применяемых для оценки качества воды по микробиологическим показателям. В ускоренном методе исключен предварительный этап разведения модельных микроорганизмов. Контроль проводится на двух штаммах модельных микроорганизмов, различающихся размером и формой клеток. Разработанный алгоритм применялся также для оценки качества трековых мембран из полиэтилентерефталата. При этом «процент извлекаемости» модельных микроорганизмов для трековых мембран составил более 80%, что удовлетворяет требованиям международного стандарта ISO 7704-85.

Ключевые слова

анализ , качество воды , контроль , мембранный фильтр , микробиология , микроорганизмы

Скачать статью в журнальной верстке PDF

Фильтрация является неотъемлемой частью оценки качества воды по микробиологическим показателям. Получение достоверных, точных, репрезентативных результатов напрямую зависит от типа мембранного фильтра, применяемого для концентрирования бактерий из исследуемой воды, а также от качества мембран, которое зависит от материала и производителя. Поэтому при поступлении в аналитическую лабораторию новой партии фильтров, а также при принятии решения о продлении срока годности мембранных фильтров осуществляется контроль их эффективности.

В России контроль эффективности мембранных фильтров проводится согласно методическим указаниям МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды», которые составлены на основе международного стандарта ISO 7704-85.

Контроль проводится в течение длительного времени (с момента первого посева до учета результатов проходит четыре дня), является трудоемким и недостаточно достоверным (ведется только по одному модельному микроорганизму – E. coliМ 17-02).

По результатам сравнительных экспериментальных исследований разработан, апробирован и предложен алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров по расчету «процента извлекаемости» тест-бактерий относительно прямого посева. С целью максимального приближения к натурным условиям контроль проводится на двух штаммах модельных микроорганизмов, различающихся размером и формой клеток (палочковидной – E. coli 1257 и кокковой – Ent. faecalis 29212).

Алгоритм оценки заключается в следующем. За день до исследования производят пересев тестовых культур E. coli 1257 и Ent. faecalis 29212 со среды хранения (из запасов рабочей коллекции) на чашки Петри с питательным агаром. На следующий день из полученных агаровых культур готовят суспензии тестовых штаммов в стерильном разбавителе (пептонном солевом растворе) с концентрацией 10⁹ кл/мл, используя оптический стандарт мутности. Выполняют последовательные десятикратные разведения полученных стандартных суспензий до концентрации тестовых микроорганизмов – 10³ кл/мл.

Из разведенных суспензий производят параллельные посевы культур тестовых микроорганизмов способом мембранной фильтрации и прямым (поверхностным) способом. На данном этапе предварительный посев модельных микроорганизмов и последующее их хранение в холодильнике до непосредственного использования исключены, поскольку при хранении концентрация микроорганизмов может измениться за счет частичного отмирания клеток бактерий и оседания их на стенках пробирки. Необходимо выполнить до десяти повторов посева каждым способом.

Из разных упаковок исследуемой серии выбирают по два мембранных фильтра и подготавливают их в соответствии с инструкцией производителя. Для выбранных штаммов тест-микроорганизмов методы посева аналогичны. Посевы производят на питательный агар (одной партии изготовления), разлитый в чашки Петри.

При посеве методом мембранной фильтрации (при отключенном вакууме) наливают в воронку фильтровального прибора 20 мл стерильного разбавителя (стерильная водопроводная вода). После тщательного перемешивания суспензию тест-микроорганизмов (0,1 мл) микропипеткой вносят непосредственно в фильтровальную воронку с разбавителем (в центр воронки, не касаясь ее стенок и разбавителя). Это позволяет исключить потерю клеток тест-бактерий, как в случае с многократными переливаниями при внесении посевной дозы сначала в пробирку с разбавителем, а затем в воронку. Кроме того, значительно сокращается работа по выполнению данного анализа.

Содержимое воронки отфильтровывают под вакуумом. Ополаскивают воронку стерильной водопроводной водой (20 мл). Смыв профильтровывают через этот же фильтр. После окончания фильтрования при отключенном вакууме мембранный фильтр переносят на чашку с питательным агаром. Посевы инкубируют в термостате при 36 ± 2 °С в течение 18–24 ч.

После инкубации подсчитывают количество колоний E. coli и Ent. faecalis, выросших на каждом фильтре. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний при посеве методом мембранной фильтрации.

Для прямого поверхностного посева используют материал с разведением культуры тестового микроорганизма из той же пробирки, что и при мембранной фильтрации.

Для однородности суспензии тестовых культур тщательно перемешивают. Инокулят объемом 0,1 мл асептически помещают на поверхность питательного агара той же микропипеткой, которой делали посев на мембранный фильтр. Выполняют до 10 повторных посевов. Стерильным стеклянным шпателем культуру равномерно распределяют по поверхности питательного агара до полного высыхания. Чашки переворачивают и инкубируют в термостате при 36 ± 2 С в течение 18–24 ч.

Таким образом проводят посев суспензии каждого тест-микроорганизма на 5–10 испытуемых фильтрах.

На следующий день вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на чашках при прямом поверхностном посеве.

Далее по формуле, приведенной в МУ 2.1.4.1057-01, вычисляют «процент извлекаемости»:

где И – процент извлекаемости; СЧ_мф – среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на фильтрах при посеве методом мембранной фильтрации; СЧ_ч – среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на чашках при прямом поверхностном посеве.

Согласно международному стандарту ISO, пригодными считаются мембранные фильтры, у которых «процент извлекаемости» составляет не менее 80%.

На рисунке представлены алгоритмы проведения анализа мембранных фильтров: действующий (в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01) и предлагаемый ускоренный метод (апробирован при оценке качества мембранных фильтров различных марок, партий и производителей).

Разработанный алгоритм применялся также для оценки качества нового вида мембранных фильтров, ранее не используемых в бактериологии, – трековых мембран из полиэтилентерефталата (диаметр пор 0,4 мкм). Проведено пять серий независимых испытаний, в каждом из которых брали по десять мембранных фильтров для двух культур модельных микроорганизмов. Полученные значения «процента извлекаемости» (таблица) подтверждают высокую надежность трековых мембран при выполнении анализа воды по бактериологическим показателям.

Выводы

Разработанный ускоренный метод контроля эффективности мембранных фильтров позволяет сократить время проведения исследования одни сутки, упрощает проведение посева методом мембранной фильтрации, повышает надежность анализа благодаря введению второго модельного микроорганизма с другими формами и размером клеток.

Российская ассоциация водоснабжения и водоотведения